DEFINICIÓN



La Microbiología Industrial se puede definir como la aplicación de la Microbiología en procesos industriales, siendo su materia prima los microorganismos, que serán los encargados de actuar mediante métodos catalíticos .
Los microorganismos pueden ser considerados en términos generales con dos criterios que son antagónicos. Uno corresponde a las actividades útiles que tienen algunos para obtener bienes o servicios y otro completamente distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que están generalmente asociados a la producción de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y que también se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos.
https://cv2.sim.ucm.es/moodle/file.php/21298/Clases_de_teoria/Tema_8_Microbiologia_de_los_alimentos_industrial_y_ambiental/Tema60AG.pdf






Todos los organismos producen metabolitos primarios (aquellos que intervienen en las rutas centrales del metabolismo y que son esenciales para la supervivencia y, en general, idénticos en todo tipo de organismos) y secundarios. Estos últimos son específicos de cada tipo de organismo y están involucrados en el establecimiento de las relaciones ecológicas del organismo productor.


La Microbiología Industrial trata de utilizar microorganismos para que produzcan compuestos o realicen funciones que sean útiles desde un punto de vista aplicado. Comprende el cultivo de microorganismos para su propia producción como alimento y para la producción y transformación de fármacos, alimentos, disolventes orgánicos, etc.
Para poder utilizar microorganismos en procesos aplicados debemos conocer los principios básicos del funcionamiento celular y del cultivo controlado de microorganismos. Para cada producto o transformación concreta será necesario, además, determinar qué microorganismo es el más adecuado para llevarlo a cabo.

Un documento presentacion sobre la microbilogia industrial y fermentaciones


























A continuación presentamos un video acerca de la microbiología industrial:





























HISTORIA

Las aplicaciones de los microorganismos datan de tiempo inmemorial. El hombre hizo uso de ellos sin saber que éstos existían desde que inventó o descubrió al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era conocida antes del 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existía ya verdadera producción en 1700 a.C.; el vinagre se producía desde antes de esa fecha y el vino es también muy antiguo, ya que existe evidencia de su producción antes del 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente el pan se conoce desde 4000 a.C. aproximadamente.
Se puede afirmar que hasta comienzos del siglo X existe muy poco o ningún control de los procedimientos utilizados para la elaboración de esos productos o alimentos.
A partir de 1900 comienza la etapa de producción de una serie de productos nuevos que se suman a los conocidos desde la más remota antigüedad, y que son la levadura de cerveza, glicerol, ácido láctico, acetona butanol y etanol.

Hasta el 1945 poco se esperaba del futuro de la Microbiología Industrial, ya que solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos, y además varios de esos productos podían obtenerse por otras vías, ya más convenientes por razones económicas, como etanol, ácido láctico o acetona butanol.

Con el advenimiento de la penicilina en 1945 y la necesidad de su producción, se produce un impacto formidable sobre los procedimientos microbiológicos, ya que se plantea el desafío de la producción en gran escala en condiciones de mucho mayor control y con necesidad de operaciones más complejas para la separación y purificación de los productos. Como consecuencia de los avances logrados en esos desarrollos se produce en pocos años la aparición de un gran número de nuevos productos, como otros antibióticos, aminoácidos, esteroides, enzimas, biomasa aplicada a la alimentación animal y humana (proteínas unicelulares), nucleótidos, etc.
A partir de 1979 la Microbiología Industrial recibe un nuevo y notable impulso que se suma al anterior cuando se concretan a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que ofrece la ingeniería genética, disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biología Molecular. Este nuevo impulso posibilita la producción industrial, basada en la utilización de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa vía como la insulina, hormona de crecimiento, interferón y otras de muy reciente aparición en el mercado de productos relacionados con el área de la salud.
Con la evolución cronológica comentada se fue también produciendo una evolución en los conceptos involucrados, ya que con el avance de los conocimientos y sobre todo con la necesidad de resolver problemas de producción vinculados a procesos cada vez más complejos, se fue haciendo necesaria la participación de ingenieros y bioquímicos además de los microbiólogos, y se fue produciendo también la integración de conocimientos provenientes de varias disciplinas. Se fue profundizando, por ejemplo, el estudio de los microorganismos de interés industrial, no sólo en sus aspectos microbiológicos, sino también en relación a los requerimientos surgidos de las aplicaciones industriales de los mismos. Se fue así diferenciando la metodología general empleada en la selección, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos, ya que estos aspectos debían orientarse a los productos de interés y al aumento de la productividad de las cepas empleadas. Lo mismo sucedió con los requerimientos: de los medios de producción que deben incluir consideraciones económicas además de las microbiológicas. En los aspectos tecnológicos se produjeron también evoluciones necesarias, ya que de las cubas clásicas de fermentación construídas de materiales diversos y con poca instrumentación se pasó a biorreactores de acero inoxidable muy instrumentados.








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LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS INDUSTRIALMENTE


En los microorganismos, como en cualquier célula, ocurre una serie de reacciones químicas cuyo conjunto se denomina metabolismo, las sustancias que se producen se conocen como metabolitos. Los metabolitos primarios son los compuestos esenciales para el crecimiento del microorganismo, mientras que los productos sintetizados que no están relacionados con su crecimiento se conocen como metabolitos secundarios. Los metabolitos primarios se producen al mismo tiempo que se da el crecimiento del microorganismo, mientras que los metabolitos secundarios se producen generalmente cuando la velocidad de crecimiento de los microorganismos es igual a su velocidad de muerte. (Herdández, A. 2006)
Durante un proceso industrial, es importante que el microorganismo participante se desarrolle de tal forma que se maximice la producción del compuesto de interés. Los compuestos de interés pueden ser:

  • Los mismos microorganismos (más conocidos como biomasa).
  • Los metabolitos: primarios y secuandarios.

En forma natural, los microorganismos elaboran únicamente la cantidad de metabolitos necesaria para sus subsistencia; si embargo, si se conoce su metabolismo, es posible alterarlo para lograr la sobreproducción de algún compuesto particular.
Los microorganismos más utilizados son las levaduras, los mohos y las bacteria. (Herdández, A. 2006)

Las levaduras

Son los microorganismos más importantes desde el punto de vista industrial, porque muchas de las especies pueden convertir los azúcares en alcohol etílico y dióxido de carbono. Participan en la producción de cerveza, vino, alcohol industrial, glicerol y vinagre. Las células de levadura se utilizan también en la industria de la panificación y como alimento animal y humano, por su alto contenido de proteínas.

El alcohol se encuentra en bebidas como la cerveza, el vino y el brandy. Es disolvente de productos como lacas, pinturas, barnices, colas, fármacos y explosivos. También como base para la elaboración de productos químicos de elevada masa molecular. (25) Puesto que gran cantidad de residuos que contienen hidratos de carbono, de precio muy reducido, pueden aprovecharse en la fabricación de alcohol etílico, el valor actual de los procesos de fermentación tiende a crecer en el futuro.


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Para conocer mas sobre los procesos de fermentacion alcoholica: http://www.maestrakena.com/res_files/libro/unidad6_libro.pdf

Los mohos

Se han utilizado especialmente en la producción de antibióticos, enzimas, vitaminas y ácidos orgánicos, tales como el cítrico, el láctico y el glutámico; también, en la maduración de varias clases de queso, como Roquefort.

Las bacterias

Han sido utilizadas para la producción de vinagre, ácido glucónico y cetoglucónico. Las Acetobacter conforman un grupo de especies oxidantes, entre las cuales se encuentran aquellas productoras de vinagre, dióxido de carbono y sorbitol. Otro grupo de bacterias, de gran importancia desde el punot de vista industrial son las Lactibacillus delbrueckii, denominación que se debe que el ácido láctico es el producto principal de su metabolismo.



aplicacion microorganismos industria.png
http://www.quimicaindustrialhn.net/recursos/descargas/doc_view/29-microbiologia-industrial-y-alimentaria.raw?tmpl=component



ÁREAS DE APLICACIÓN



Las áreas principales son: salud, alimentos, producción vegetal y animal, insumos industriales, minería y servicios.
  • En primer lugar se debe destacar la importancia de la Microbiología Industrial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicación en la producción de compuestos de actividad farmacológica y vacunas.
  • En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la Microbiología Industrial en la producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lácteos, etc.
  • La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción vegetal y animal por un conjunto variado de procesos microbiológicos que se han enriquecido notablemente en los últimos años con la utilización de técnicas de ingeniería genética.
  • El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación o sea con la aplicación de microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley.
  • Finalmente el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de microorganismos en la purificación de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.




Microorganimos usados para la obtención de distinos productos.
Microorganimos usados para la obtención de distinos productos.

Los antibióticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibióticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico tienen importancia clínica. En las bacterias existen muchos grupos taxonómicos que producen antibióticos. La mayor variedad en estructura y número de antibióticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el género Streptomyces.

La obtención de mejores antibióticos se lleva a cabo por modificación de los compuestos conocidos utilizando medios químicos o genéticos (mutasíntesis, fusión de protoplastos, tecnología del DNA recombinante). Sin embargo, solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibióticos con estructuras básicas enteramente nuevas, especialmente por la utilización de nuevos procedimientos de prueba y por la investigación en nuevos grupos de microorganismos.

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxígeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 volúmenes de aire (volumen de líquido)-1min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura óptima es de 25-27°C.


Microbiologia en La Industria




PROCESOS DE FERMENTACIÓN



Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transforma dos por acción microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos crecimiento y formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente o no según los casos.

Las fermentaciones industriales se definen como procesos industriales, en los que los microorganismos son una parte muy activa del proceso productivo. El microorganismo es lo más importante en las fermentaciones industriales y los aspectos de ingeniería siempre están supeditados al organismo. En base a cual y como sea mi biocatalizador, y que producto quiera que sintetice, tendré que elegir, para diferentes aspectos, las condiciones que sean las más adecuadas para mi biocatalizador.

El desarrollo de una fermentación industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus nombres en inglés, procesos upstream y procesos downstream. Los primeros comprenden la selección y preparación del microorganismo, la preparación del medio de cultivo y de las condiciones de fermentación. Los segundos incluyen la purificación del producto y el tratamiento de los residuos de la fermentación.
En el proceso de fermentación del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los procesos upstream de la selección y preparación de cepas de levadura, tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de fermentación. Los procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificación y el de los residuos del proceso.

Los procesos fermentativos han sido utilizados y desarrollados por el hombre desde hace aproximadamente ocho mil años, a pesar de que no se conocía la existencia ni la influencia de los microorganismos en esos procesos. (Hernández, A. 2003)

Desde del punto de vista bioquímico, una fermentación se define como un proceso mediante el cual las sustancias orgánicas (sustrato) sufren una serie de cambios químicos (reducciones y oxidaciones) que producen energía: al finalizar la fermentación, se presenta una acumulación de varios productos, unos más oxidados (aceptaron electrones) y otros más reducidos (donaron electrones) que el sustrato, con un balance total de energía positivo. Esta energía es utilizada en el metabolismo de los microorganismos. (Hernández, A. 2003)

Desde el punto de vista microbiológico, se entiende por fermentación aquel proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomas, a partir de la utilización de sustancias orgánicas, en ausencia o presencia de oxígeno. La descomposición de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por los microorganismos para tal finalidad. (Hernández, A. 2003)

La gran cantidad de procesos y productos que involucran el término fermentación hace difícil no solo la definición del concepto, sino también su clasificación. En general, se establecen divisiones con base en:

  • El tipo de producto final por obtener.
  • La presencia o ausencia de oxígeno en el proceso.

(Hernández, A. 2003)

Factores que influencian el desarrollo microbiano:El comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de la interacción que se produce entre el microorganismo y el medio ambiente en el reactor, y que en rigor es el resultado de los llamados efectores intra y extra celulares.
Los efectores internos están representados por la dotación genética intrínseca del organismo considerado y por sus mecanismos de regulación metabólica. Estos últimos pueden ser modificados por alteraciones del medio ambiente o más precisamente por los efectores externos mientras que la existencia de un gen depende de la especie del microorganismo considerado. Un gen está o no está, sólo su expresión puede modificarse. Con el fin de mejorarla productividad de un proceso de fermentación las cepas empleadas pueden someterse a tratamiento físico o químico de mutación que al alterar algún sector del genoma logran aumentar la producción de un metabolito aunque también pueden disminuirla o incluso suprimirla.
También se puede dotar a un microorganismo de una capacidad genética nueva cuando se efectúa la inserción de sectores del genoma de una especie en un microorganismo, haciéndose éste capaz de producir metabolitos que desde el punto de vista genético de su especie no podría hacerlo. La obtención de mutantes por el uso de agentes mutagénicos o por algún otro mecanismo bioquímico y la construcción de cepas nuevas por ingeniería genética constituyen los recursos de la genética microbiana, para mejorar la productividad de un microorganismo dado o para dotarlo de una capacidad productiva nueva. Es decir que los efecto- res internos pueden modificarse para lograr la optimización de un proceso fermentativo. Todos estos aspectos serán considerados especialmente en el capítulo siguiente, que corresponde al mejoramiento de los microorganismos de interésindustrial.
El comportamiento o expresión fenotípica, o sea lo que realmente se observa como respuesta del microorganismo al medio ambiente en el reactor es, además, el resultado de la influencia de las variables de naturaleza física y química que constituyen los efectores externos.
Los efectores externos de naturaleza física están vinculados con las condiciones de operación que se utilizan en los reactores y son por ejemplo la temperatura, la agitación, aireación, etc; es decir, están constituidos por las variables de manipulación física que se fijan o se programan en el curso del proceso de producción.

La modificación de algunos de los efectores físicos como por ejemplo la temperatura, tiene un efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es adecuado puede disminuir o aún impedir la formación de un metabolito determinado. Además la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de algunos microorganismos, lo que significa que al modificarse el valor de un efector puede cambiar los requerimientos de otro.
Los efectores externos de naturaleza química están representados por la presencia de los componentes de los medios de fermentación. Los componentes de los medios deben cumplir con todos los requerimientos nutricionales y además con los requerimientos específicos que son indispensables para la formación de productos.
Los reactores están también estrechamente vinculados al manejo o manipulación de los efectores externos, ya que además de la regulación de las variables físicas permiten según el modo de operarlos fijar o regular la alimentación de componentes de los medios que, como ya se dijo, constituyen los efectores químicos. Tal es el caso cuando se operan los reactores en "batch" o en forma discontinua, (todos los componentes son colocados desde un comienzo en el medio de pro- ducción) o cuando se opera el reactor en"batchalimentado" donde la alimentación de los componentes se realiza en forma controlada durante el proceso. Finalmente cuando se opera el reactor en continuo, se alimenta medio completo a una determinada velocidad al mismo tiempo que se deja salir con la misma velocidad del medio fermentado, lo que permite tratar a la velocidad de crecimiento específico como variable independiente.

Factores que influyen en el crecimiento microbiano
Factores que influyen en el crecimiento microbiano




Existen una serie de aspectos de ingeniería que se deben considerar.



SALTOS DE ESCALA

Salto de escala Implica el paso en el cual un procedimiento desarrollado con éxito en el laboratorio, en volúmenes reducidos, es modificado para ser usado en fermentaciones de gran tamaño, manteniendo las mismas condiciones. Implica la modificación de algunas condiciones de fermentación necesarias para mantener la productividad al variar algunas condiciones, como suelen ser dimensionales. Es necesario el salto de escala, el reajuste de algunos parámetros, cuando pasamos de laboratorio a planta industrial, debido al gran incremento en las proporciones. También es necesario un reajuste, cuando implementamos el uso de una nueva cepa con un rendimiento entre un 10 y un 20% superior a la anterior, ya que el cambio en la producción puede implicar cambios en las condiciones.

El problema del salto de escalas viene dado por el hecho de que en las primeras fases se ha de comprobar el funcionamiento de la bacteria en el laboratorio, donde los objetivos son diferentes que en la planta. En el laboratorio se intentan optimizar la producción en términos puramente cuantitativos, mientras que en la planta es la optimización del rendimiento, considerando también los costes.


TIPO DE PROCESO SEGUN LA RELACION BIOCATALIZADO Y AGUA

Dependiendo del tipo de biocatalizador que tengamos, y de las condiciones de este, será más rentable usar un tipo u otro de medio y una determinada concentración de agua, así como inmovilizar el biocatalizador. Distinguiremos por lo tanto entre cultivos sumergidos o en superficie, así como también podremos tener el biocatalizador inmovilizado o no. Finalmente, el cultivo podrá ser sólido, semisólido o líquido.



TIPO DE PROCESOS SEGUN LA CINETICA DEL PROCESO Y LA ENTRADA DEL MEDIO

Una vez decidido como se hará, es necesario determinar la dinámica en la que realizarás el proceso, lo que depende más del producto que del microorganismo. También depende del tipo de medio que haya elegido que algunas opciones parezcan un poco sin sentido. Considerando la cinética de la entrada de medio podemos clasificar 3 tipos de cultivo:

  • Discontinuos (o batch)
  • Discontinuos con alimentación (Fed – batch)
  • Continuos

El hecho de decidir uno u otro tipo depende del biocatalizador y del producto que quieras conseguir.


Cultivos continuos
Es la aplicación del principio del quimiostato a la industria. La solución nutriente se añade continuamente al biorreactor a la vez que se extrae una cantidad equivalente de medio usado con organismos, una vez alcanzado el equilibrio.

Se usa, o se intenta usar, porque es de difícil aplicación, cuando el producto de interés se sintetiza en la fase logarítmica del crecimiento. Por lo tanto interesa que las bacterias estén en esa fase cuanto más tiempo mejor, para lo que requieren más medio. Aunque en teoría el funcionamiento podría ser ilimitado, normalmente se consideraría un éxito el pasar de las 200, puesto que conseguir mantener las condiciones en el interior del fermentador es muy difícil.


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Cultivos fed – batch
Los nutrientes críticos se añaden en baja cantidad al principio, pero continúan añadiéndose en dosis pequeñas a lo largo de todo el crecimiento, de manera escalonada. Este sistema se usa a menudo para la síntesis de metabolitos secundarios, la síntesis de los cuales está sometida a represión por el catabolito, o bien cuando el inóculo es problemático.


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Cultivos discontinuos o batch
Es el más habitual. En el inicio del cultivo, el medio estéril se inocula con un volumen adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentación en condiciones óptimas. A lo largo del proceso no se añade ningún nutriente, salvo el oxígeno. Llega un momento, por lo tanto, en que los nutrientes son limitantes para el crecimiento, por lo que se dan las fases típicas de un cultivo bacteriano.


ESQUEMA DE PROCESO INDUSTRIAL


Existen 4 etapas bien diferenciadas, a saber:
1) Propagación de cultivos, lo que se realiza en el laboratorio y que comienza generalmente en un tubo de ensayo que contiene un repique reciente del microorganismo o un tubo liofilizado o congelado donde se conserva la cepa de interés o de una colonia del microorganismo previamente seleccionada. Este material microbiológico seleccionado constituye el punto de partida con el cual se debe aumentar la cantidad del mismo mediante sucesivos pasajes en frascos de volúmenes crecientes que son generalmente operados en agitadores de vaivén o rotatorios en cámaras de cultivo.
2) Fermentación: con el material obtenido anteriormente, se siembra el tanque de inoculo que puede tener un volumen de 50, 500 ó 1000 según la escala industrial posterior. Del tanque de inoculo se pasa posteriormente al fermentador industrial cuyo volumen, que varía de acuerdo al producto a obtener y a su concentración, está comprendido comúnmente entre 10,0 y 100,0 L. En algunos casos especiales, como en la producción de proteína unicelular, los tanques de fermentación pueden llegar hasta 1000L. Un proceso esencial ligado a la producción es la preparación y esterilización de los medios que se lleva a cabo también en esta etapa (previamente a la inoculación) ya sea en el tanque de inóculo o en el reactor industrial.
3) Operaciones y proceso de separación y purifición de los productos; estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente: a) separación de insolubles por filtración, centrifugación, o decantación; b) separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración; c) purificación por extracción líquido-líquido, o extracción a dos fases acuosas, o cromatografía de afinidad, y finalmente d) aislamiento del producto.
4) Tratamiento de efluentes: si bien no tiene una relación directa con el producto, que es la razón de ser de la industria de fermentación, representa una etapa imprescindible porque es fundamental controlar la calidad del efluente que sale de la fábrica y que es enviado generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un río o al mar.


Esquema de un proceso industrial
Esquema de un proceso industrial

SELECCIÒN, MEJORAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL


En la selección de un microorganismo se deben tomar en cuenta los siguientes aspecto:
  • Costo reducido de cultivo
  • Características particulares
  • Fácil extracción del medio de cultivo

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos casos se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios.

Una vez realizada la selección se procede al aislamiento, para ello existen varios métodos como: a) aislamiento directo, o b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.

a) Aislamiento directo:
En este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento permita la máxima expresión del material genético del organismo. Si se busca por ejemplo un organismo con acción antimicrobiana, se puede crecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia de los organismos contra los cuales se requiere la acción antimicrobiana, observándose la producción del inhibidor por las zonas de inhibición de crecimiento.
Para la detección de productores de factores de crecimiento tales como aminoácidos y nucleótidos se utiliza la estimulación del desarrollo de bacterias auxótrofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios sólidos. En este caso se debe tener una "réplica" de la caja a ensayar. Una vez obtenido el crecimiento en la primer caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las colonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensión del organismo auxótrofo al producto buscado. Después de un período de incubación se observa crecimiento en forma de halo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placa réplica.
b) Enriquecimiento del cultivo:
Esta técnica consiste en incrementar en una población mixta el número de organismos de interés en relación al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos me diante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos específicos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos periódicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de interés sea el dominante de la población, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio sólido.
c) Mantenimiento o conservación de los cultivos:
Los objetivos de la conservación de los cultivos son:
  • preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades bioquímicas
  • preservar los niveles de su productividad inicial
  • lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto último puede ser un factor esencial en la selección de un método de preservación.


En todo trabajo de Microbiología se deben conocer las características de la población con la cual se va a trabajar (propiedades morfológicas y bioquímicas). En este sentido, tanto en la conservación como en el desarrollo del cultivo, ya sea el que suministra o el que recibe la cepa, deberían usar las mismas técnicas metodológicas. Tanto para el mantenimiento, preparación y propagación de inóculos se deben usar métodos reproducibles que no produzcan variaciones o pérdidas de las características de la cepa empleada.
No hay métodos de mantenimiento en procesos industriales que seán comunes a todas las industrias, empleándose en algunos casos métodos específicos secretos.
El conocimiento de las características del cultivo es esencial en la elección de un método de preservación. La identidad del cultivo puede conocerse en base a sus características de crecimiento en uno o más medios específicos, tomando en consideración propiedades macro y microscópicas exhibidas, o en base a una evaluación más exhaustiva empleando muchos ensayos bioquímicos, biológicos, inmunológicos y genéticos.
En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de determinar en cada etapa si ha habido o no alteración genética. En la mayoría de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables u observables tales como pigmentación, morfología, reacciones fermentativas, pro- piedades microscópicas, etc. El análisis de estos parámetros junto con la determinación cuantitativa del recuento de colonias antes y después del proceso de mantenimiento brindan la información necesaria para la correcta evaluación de la técnica de conservación a elegir.

Los métodos de preservación o mantenimiento más importantes son los siguientes:

  • Subcultivos

Es un método común de conservación, que consiste en el repique periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia varía con el microorganismo, debiendo considerarse el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 °C durante lapsos que oscilan entre 15 días y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios: a) incremento de la posibilidad de mutación con cada transferencia, con pérdida de las características del organismo; b) riesgo de contaminación; c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estadía en frío, en la cual se produce una desecación gradual del mismo.

  • Mantenimiento bajo capa de aceite

Es una técnica simple y efectiva para prolongar la conservación de muchos organismos y consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrrollo en medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o aún mejor en hela- dera por períodos de varios años. Algunos autores sostienen que en estas condiciones los microorganismos pueden continuar reproduciéndose, con posibilidades de aparición de mutantes; sin embargo se acepta que estas alteraciones no se observan hasta los tres años de mantenimiento.


  • Congelación

Debido a que la actividad metabólica de una célula se reduce considerablemente por mantenimiento a muy baja temperatura, la congelación es una técnica de elección, ya sea para cortos o largos períodos de tiempo. A esto ha contribuido también la mayor disponibilidad de nitrógeno líquido (-196 °C) y el mejoramiento de los equipos de refrigeración. La técnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las células son más resistentes a los daños por congelación y descongelación, que las de fase exponencial. También es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congelación, debido a que, cuando parte de las células se lisan se liberarían sustancias crioprotectoras que aumentarían el porcentaje de células sobrevivientes.
Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El más empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como dimetilsulfóxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de malta, han sido también empleados.
La suspensión celular es colocada en ampollas (vidrio o plástico) y sellada antes de colocarla bajo nitrógeno líquido. Uno de los problemas de esta técnica se refiere a la velocidad de congelación.
Muchos estudios son coincidentes en señalar que una velocidad de congelación lenta y una rápida descongelación rinden los mayores números de células viables. Se encontró que dependiendo de la naturaleza de las células, existe una velocidad de congelación óptima en cada caso para obtener una máxima sobrevida. Como criterio general se puede decir que, lo más ampliamente usado es el enfriamiento a 1 °C min-1 (ya que una rápida congelación causa ruptura de membranas) hasta -20 °C y luego un rápido descenso.
En cuanto a la temperatura de conservación, la más baja recomendada es -70
°C, ya que a temperaturas más altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son letales para las células.
En caso de nitrógeno líquido, la conservación podría prolongarse por años, asegurando una buena provisión del mismo y disponiendo de equipos con sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de temperatura.


  • Liofilización

La liofilización está considerada como el método más adecuado para la preservación de microorganismos. La técnica involucra el congelamiento de un cultivo seguido por un secado bajo vacío, lo cual resulta en la sublimación de agua de la suspensión celular. La ventaja es que la mayoría de los organismos sobreviven al secado y el cultivo es fácilmente mantenido aún a temperatura ambiente sin pérdida significativa de viabilidad.
La liofilización es apropiada para la conservación de la mayoría de las bacterias, encontrándose que las Gram positivas sobreviven mejor que las Gram negativas cuando se las liofiliza y mantiene en condiciones similares. También se em- plea en la conservación de esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras. Sin embargo, no es adecuada para células animales, algas y hongos en fase de micelio.
La técnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las células son usualmente más resistentes) resuspendiendo las células con un medio crioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotas de suspensión celular son transferidas a una ampolla, la cual es congelada a aproximadamente -40 °C y deshidratada mediante una sublimación en vacío. Este debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado continúa has- ta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada bajo vacío. Se debe evitar la formación de radicales libres que se producen por exposición de las células al oxígeno, ya que están asociados con pérdida de viabilidad; de allí la importancia de mantener el vacío.

PREPARACION DE MEDIOS


La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro
c) Factores de crecimiento, que están constituídos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc..

Los medios pueden clasificarse, considerándo la naturaleza química de los componentes, en:
1) medios sintéticos o medios químicamente definidos
2) medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable.

Diseño

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos, como es el caso de la importancia del anión fosfato.

Requerimientos nutricionales
Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial está determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes más comunes en el metabolísmo energético. En la ausencia del 02 ,el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4para obtener energía. Otras protistas obtienen su energía, en condiciones anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.
Otro requerimiento nutricional está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su incorporación a la pared de la células. En algunos casos se requieren también péptidos de histidina.
Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.
Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como catión en la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ión Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías:
a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co,Cuy Zn
b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V,Cr, Ni, As, Se, Mo,Sn, e I.
En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo.
Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, cte..
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso considerado.Un ejemplo es el caso de los precursores que constituye la base de una molécula que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el ácido fenil acético para la penicilina.
El agregado de sulfato, en el proceso de fermentación alcohólica, que favorece la formación de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento específico.
El diseño correcto tiene que ver con las características bioquímicas propias y evolución de los parámetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por un descenso continuo de pH,debido al uso de una sal de amonio como fuente de nitrógeno, obliga a considerar en su diseño algún agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como más generalmente se hace, con agregados periódicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma más conveniente mediante un control automático de pH.El diseño de un medio específico para la producción de ácido cítrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composición; por lo tanto dicho medio debe diseñarse de manera tal que su preparación (a partir de diversas materias primas) considere una eliminación total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas.
Disponibilidad de los componentes

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la célula.

Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metálicos cuya concentración es modificada por quelación, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actúan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminoácidos, hidroxiácidos, hidróxidos, y los aniones P042- y C032-

Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentración y prevenir la precipitación de los iones metálicos, es necesario o esencial quelar el ión mediante algún agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraacético).

En medios complejos de uso industrial la situación es aún más complicada ya que existe una gran variedad de sustancias orgánicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metálicos reduciendo la concentración iónica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminoácidos, proteínas, ácidos orgánicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.

En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unión a elementos metálicos disminuyendo su concentración efectiva, como ocurre también con los aminoácidos y proteínas que tienen los grupos reactivos R-COO, RH, RS y RO, que son lo más importantes. La dinámica de la formación del complejo está determinado
por la constante de equilibrio de formación del complejo metal-ligando, y por la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la formación del complejo del ión metálico (M) con el ligando (L) se expresa de la siguiente forma:

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En esta ecuación, las cargas del catión y ligando están omitidas.
El valor de K es prácticamente independiente de la naturaleza del ligando, ya que depende particularmente del ion metálico. Se puede hacer una lista de términos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue: Fe+3 > irán en forma de iones metálicos libres.

Materias primas fundamentales

Los componentes empleados en la industrias de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo de los medios.
Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno.

Las fuentes de carbono pueden ser:
1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina;
2) Alcoholes como el glicerol y manitol;
3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.

Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería, alpechín y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos.

Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el amoníaco o las sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser:
1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc..Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe yCu.
2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma.
3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada
5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas.

Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas.


En este link nos lleva al proceso de producción de Penicilina, con información del proceso utilizado y todos los requerimientos necesarios :


http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap9_mi.pdf













REFERENCIAS: